Оптимизация комплектов праймеров и протоколов обнаружения вируса SARS-CoV-2, вызывающего коронавирусную болезнь (COVID-19) за счет использования методики ПЦР и ПЦР в реальном времени.

Автор: Myungsun Park, Joungha Won, Byung Yoon Choi & C. Justin Lee

Опубликовано:Experimental & Molecular Medicine (2020), 16.06.2020

Перевод: Анна Ковалева, Фонд профилактики рада

Аннотация

SARS-CoV-2 очень контагиозен и быстро распространился по миру. Из-за симптоматических и асимптоматических случаев, а также способности вируса передаваться при полном отсутствии симптомов необходимо создать быстрый и точный протокол обнаружения, чтобы диагностировать вирус у людей, не проявляющих внешних признаков болезни. Разные наборы для диагностики и выявления SARS-CoV-2 стали доступны благодаря различным компаниям и министерствам здравоохранения разных государств. Однако информация об этих наборахпо-прежнему не доступна широкой публике. В нашем прошлом исследовании в ответ на растущую потребность при одновременной нехватке информации мы разработали и сделали широкодоступным бюджетный, легкодоступный, основанный на использовании метода ПЦР в реальном времени протокол для раннего распознавания вируса. Во время работы над протоколом обнаружения мы выяснили, что неоптимизированные комплекты праймеров могут непроизвольно показывать ложноположительные результаты. Находящиеся в продаже диагностические наборы также могут содержать комплекты праймеров, которые будут производить ложноположительные результаты. В этой статье мы приводим 3-ступенчатое руководство по дизайну и оптимизации специфических комплектов праймеров. Эти 3 ступени включают: (1) отбор комплектов праймеров по целевому гену (RdRP, N, E и S) в интересующем геноме (SARS-CoV-2), (2) создание компьютерной модели для валидации последовательностей праймеров и ампликонов, (3) оптимизация условий ПЦР (например, концентрация праймеров и температура отжига) для специфичной гибридизации между праймерами и целевыми генами и устранения ложных димеров праймеров.

Далее расширили уже существовавший протокол, основанный на методе ПЦР в реальном времени, до более традиционного протокола, основанного на методе ПЦР, и применили мультиплексный ПЦР-протокол, который позволяет одновременно тестировать наборы праймеров на RdRP, N, E и S в одной реакции. Наш заново оптимизированный протокол должен быть полезен для широкомасштабного и высокоточного тестирования людей, у которых отсутствуют симптомы заболевания, даже при нехватке оборудования с высокой детализацией, чтобы предотвратить дальнейшую передачу заболевания, а также для раннего вмешательства и лечения быстро распространяющегося вируса.

Введение

Тяжелый острый респираторный синдром коронавируса 2 (SARS-CoV-2) – это вирус, содержащий одноцепочечную молекулу РНК положительной полярности [1]. Именно штамм этого вируса вызывает коронавирусную болезнь 2019 (COVID-19), главные симптомы которой включают тяжелую пневмонию у человека [2], а также высокую температуру, сухой кашель, утомляемость, и, зачастую, боли в ЖКТ [3]. ВОЗ определила текущую пандемию COVID-19 как международную чрезвычайную ситуацию в области общественного здравоохранения [2]. К 11 апреля 2020 эпидемия COVID-19 охватила 211 стран, а количество случаев заболевания достигло 1 700 000 человек с количеством умерших более 100 000 человек и примерно 382 000 выздоровевших [4]. Ввиду распространения пандемии возникла отчаянная необходимость в создании инструментов диагностики и лечения COVID-19. Различные компании и министерства здравоохранения выпустили разнообразные наборы для диагностики SARS-CoV-2. Большинство подобных наборов работают на использовании технологии полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР в реальном времени). Однако доступной информации о таких наборах в настоящий момент недостаточно.

COVID-19 передается от человека к человеку и распространяется преимущественно через капли, которые образуются при кашле или чихании и разлетаются на расстояние около ~ 1,8 метра (6 футов) [5, 6]. Масштаб передачи вируса во время инкубационного периода пока неясен, однако исследования показали, что пик вирусной нагрузки в глотке приходится на 4 день после инфицирования [7,8]. Еще более тревожным считается тот факт, что зафиксированы случаи бессимптомной передачи вируса (от человека- носителя вируса до того, как у него проявятся признаки заболевания) [9]. Вирулентность SARS-CoV-2 оценивается согласно его показателю репродукции (R0) [10]. R0 показывает, скольким еще людям зараженный человек может передать вирус. ВОЗ оценил показатель репродукции SARS-CoV-2 в пределах от 1,4 до 2,5 [10]. Однако шведские исследователи определили средний R0 в 3,28, а максимальный в 6,49, что значительно превышает оценки ВОЗ. В более поздних исследованиях Sanche и др. определили медианное значение R0 в 5,7 (95% доверительный интервал 3,8-8,9) [11]. Способность к распространению у SARS-CoV-2 выше, чем у предыдущего SARS-CoV (SARS), показатель R0 которого распределялся между 2 и 5 [12]. Высокоинфекционная природа SARS-CoV-2 требует быстрого распространения протоколов обнаружения, инструментов диагностики и способов лечения.

Различные компании и министерства здравоохранения представили большое количество диагностических наборов SARS-CoV-2. Однако существует определенное количество очевидных ограничений для использования существующих методов диагностики. Многие компании разрабатывали и продавали свои наборы в спешке и суете по мере роста спроса на них и без надлежащей проверки и обширных испытаний. Китай и США сообщили о проблемах с надежностью доступных наборов для тестирования в начале вспышки COVID-19 в каждой из стран [13, 14]. Республика Чехия сообщила о некорректных результатах ~80% тестов, которые они приобрели в Китае [15]. В своем недавнем отчете мы продемонстрировали возможность ложноположительных результатов, если праймеры не верифицированы на стадии создания [9]. Похожий отчет был найден в медицинском архиве и указывал на возможность ложноположительных результатов. В нем авторы сравнивали девять ранее опубликованных комплектов праймеров для выявления SARS-CoV-2 [16]. Ухудшает ситуацию то, что для многих доступных в продаже наборов нет открытой информации о критической последовательности комплектов праймеров, которые в них содержатся, что делает невозможным качественно проверить и подтвердить чувствительность каждого комплекта.

В ответ на растущую потребность при одновременной нехватке информации, мы в нашем прошлом исследовании разработали и сделали широкодоступным бюджетный, легкодоступный, основанный на методе ПЦР в реальном времени протокол для раннего распознавания вируса [9]. Во время работы над протоколом обнаружения, мы выяснили, что неоптимизированные комплекты праймеров могут непроизвольно показывать ложноположительные результаты [9]. Чтобы это исправить, мы решили разработать простые, ясные правила создания и оптимизации комплекта праймера. Дополнительно мы также расширили уже существовавший протокол, основанный на ПЦР в реальном времени до более традиционного протокола, основанного на методе ПЦР, и применили мультиплексный ПЦР-протокол, что должно способствовать широко- и легкодоступности протокола.

Материалы и методы

Набор волонтеров

Цель сбора образцов и процедура взятия мазка из глотки были одобрены Этическим Советом больницы Национального Университета Сеула (IRBY-H-1807-197-966) и надлежащим образом разъяснены каждому волонтеру. Мы получили письменное согласие от каждого волонтера. В общей сложности один волонтер принял участие в этом эксперименте (волонтер U).

Процедура взятия мазка из глотки

Процедура взятия мазка из глотки была изменена по сравнению с описанной ранее [9]. Мы использовали тампон из полиэстера с пластиковым стержнем (6.4 × 3.4 × 16.8-мм кончик, 163.3-мм длина, Каталог №: 6-6587-31, LMS, Япония) вместо тампона с деревянным стержнем. После взятия образца, тампон сразу был помещен в 1,5 мл пробирку для центрифуги(Axygen® 1.5 мл MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, Каталог №: MCT-150-C, Axygen, США). Образец сразу же передан и растворен в 200 μl TRIzol (easy-BLUE™ Total RNA Extraction Kit, Каталог№17061, iNtRON, Республика Корея) за счет энергичного перемешивания с вихрями, во время которого тампон перемещался вверх и вниз по крайне мере 20 раз. Затем дополнительно добавили 15 μl TRIzol в 1,5 мл пробирку для микроцентрифуги и снова перемешали переворачивая пробирку пять раз.

HEK-293T культура клеток для позитивного контроля

Колония клеток HEK-293T (ATCC, Лот # 70008735) была использована в качестве позитивного контроля для человеческих тканей. HEK-293T клетки представляют собой широко используемую колонию клеток, получаемую из клеточной колонии почки-293 эмбриона человека (HEK-293T ), в которой выражена мутация большого Т SV40 антигена [17]. Эти клетки были выведены в среде двойной модификации среды Игла (DMEM, Каталог №: 10-013-CV, Corning, USA), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (фетальная бычья сыворотка, подвергшаяся тепловой инактивации, Каталог № 1008214, Thermo Fisher Scientific, США) и 1% пенициллина и стрептомицина (HyClone™ Penicillin–Streptomycin Solution (100×), Каталог №: Sv30010, GE Healthcare, США). Клетки находились при температуре 37 °C во влажной атмосфере в инкубаторе с уровнем СО2 5%. В конце добавили 700 μl TRIzol в осадок HEK-293T, чтобы извлечь РНК.

Извлечение РНК

Полная РНК из образца волонтера и HEK-293T клеток (~1 × 107 клеток) была извлечена при использовании TRIzol-реагента в 1,5 мл пробирке микроцентрифуги, как описано выше [9]. Каждый образец находился в растворе TRIzol 5 минут при комнатной температуре, добавили 200 μl, перемешали, переворачивая пробирку 5 раз, пробирка отстаивалась 3 минуты и 5 минут находилась в центрифуге на 12,000 × g при 4 °C. Чистый верхний водяной слой, который содержал РНК, перелили в новую 1,5 мл пробирку, куда добавили 350 μl изопропанола.После отстаивания на льду в течение 10 минут раствор перемешали, переворачивая пробирку 5 раз. Образец центрифугировали 10 минут на 12,000 × g при 4 °C. Всплывающий слой удалили, а осадок промыли в 500 μl растворе этанола 70%. Образец снова поместили в центрифугу на 12,000 × g при 4 °C. Всплывающий слой снова удалили, а РНК-содержащий осадок просушили на воздухе в течение 5 минут. Чтобы растворить РНК-содержащий осадок, его поместили в 10 μl воды, свободной от РНКаз.Концентрацию и чистоту РНК определили с помощью NanoDrop спектрофотометра (Thermo Fisher Scientific, США) за счет вычисления соотношения оптической плотности при длине волны 260 nm/280 nm и 260 nm/230 nm.

SARS-CoV-2 РНК как позитивный контроль

Позитивный контроль, содержащий SARS-CoV-2 вирусную РНК, был получен из корейского Центра по контролю и предотвращению заболеваний (cdc.go.kr). Детальное описание того, как была подготовлена SARS-CoV-2 вирусная РНК, представлено в отдельном отчете [18]. Если коротко,SARS-CoV-2 вирусная РНК была подготовлена с помощью изъятия полной РНК из культуры клеток Vero, зараженной клоном вируса BetaCoV/Korea/KCDC03/2020, на MOI 0.05. Колония клеток Vero изначально была извлечена из эпителиальных клеток почки африканской зеленой обезьяны (резус макака) [19].

Обратная транскрипция

РНК преобразовали в комплементарную ДНК (кДНК), используя SuperScript™ III First-Strand Synthesis System (Каталог №: 18080051, Invitrogen™, США), следуя процедурам, рекомендованным производителем, с некоторыми отличиями. Восемь микролитров РНК использовали для синтеза кДНК и 200 U SuperScript III, 1 μl50 μM олиго (dT) [20], 1 μl50 ng/µl различных гексамеров, 1 μl 10 mM dNTPs и 9 μl смеси синтезированной кДНК добавили в реакцию. 20-μl кДНК смеси реакции синтеза находилось в инкубаторе при 25 °C 10 минут и при 55 °C в течение 1 часа, затем последовала инактивация при 80 °C в течение 5 минут.

Дизайн праймеров

Полная последовательность SARS-CoV-2 от первого пациента в корейской контрольной последовательности была получена из базы данных контрольных последовательностей Национального центра биотехнологической информации США (ncbi.nlm.nih.gov) [20]. Мы использовали инструмент Primer3 (primer3.wi.mit.edu) [21], чтобы создать комплекты праймеров. Тестирование компьютерных моделей праймеров было осуществлено на двух веб-сайтах idtdna.com и genome.ucsc.edu. На idtdna.com (sg.idtdna.com), мы предсказали вторичную структуру праймеров, ампликона и самой последовательности, а также тенденции гетеродимеризации каждого комплекта праймеров. Мы выполнили компьютерное моделирование ПЦР на genome.ucsc.edu site (genome.ucsc.edu). Комплекты праймеров были синтезированы и доставлены Cosmogenetech (Сеул, Республика Корея). Комплекты праймеров, созданные и использованные в текущем исследовании, перечислены в Таблице 1.

Тестирование праймеров методом ПЦР

Точность и эффективность каждого комплекта праймеров были проверены с помощью ПЦР-амплификации позитивного контроля, чтобы оптимизировать условия ПЦР. Для каждой реакции использовали 5 нг SARS-CoV-2 кДНК для SARS-CoV-2 специфичного целевого комплекта праймеров и 5 нг HEK-293T кДНК — для внутреннего позитивного контроля комплекта праймеров человека. Градиентный ПЦР провели при температуре отжига (Ta) от 50 °C до 65 °C в зависимости от температуры плавления (Tm) каждого комплекта праймеров. Базовые условия ПЦР были установлены согласно инструкциям производителя для каждого реагента. Мы использовали предварительно смешанный ПЦР реагент, чтобы минимизировать контаминацию. Рекомендованная оптимальная концентрация праймеров составила 100-500 нм.

ПЦР тест для определения качества кДНК

Дополнительный шаг, проверку качества кДНК, провели после синтеза кДНК, чтобы подтвердить, что надлежащий синтез кДНК был произведен для каждого образца. Для проверки человеческого внутреннего позитивного контроля использовали праймер GAPDH (Таблица 1). В этом протоколе ПЦР использовали 5нгр кДНК в качестве матрицы при следующих показателях цикла ПЦР: 94 °C на 3 min, 35 циклов при 94 °C на 30 с, 62 °C на 40 с и 72 °C на 1 мин с финальной элонгацией при 72 °C на 5 мин. Каждый праймер использовали в концентрации 500 нм в 2× ПЦР предварительно смешанного реагента (Quest Taq PCR Mix, Каталог №: QM13532, BioQuest, США). Ампликоны прошли процедуру электрофореза в 2% агарозном геле на 130 Вт в течение 20 мин и были визуализированы при использовании безопасного окрашивающего раствора нуклеиновой кислоты LUMI-Green (Nexbio, Daejeon, Республика Корея) под УФ-лучами.

Традиционный ПЦР для выявления SARS-CoV-2

SARS-CoV-2_IBS_E2, SARS-CoV-2_IBS_RdRP2, SARS-CoV-2_IBS_S2 и SARS-CoV-2_IBS_N1 комплекты праймеровиспользовали для выявления следов SARS-CoV-2. Кроме того, GAPDH комплект праймеров использовали в качестве человеческого внутреннего положительного контроля. Все условия ПЦР-теста были такими же, как при проведении процедуры по определению качества кДНК.

Мультиплексный ПЦР для выявления SARS-CoV-2

SARS-CoV-2_IBS_E2, SARS-CoV-2_m_IBS_RdRP 1, SARS-CoV-2_IBS_m_S 1 и SARS-CoV-2_IBS_m_N 1 комплекты праймеров использовали для мультиплексного ПЦР-теста для выявления транскрипта SARS-CoV-2. Общая концентрация всех смесей праймеров составила 500 нм, при этом концентрация смеси каждого вида составляла 125 нм. IBS_m_ACTB 1, IBS_m_TBP 1 и 18 S rRNA комплекты праймеров использовали в качестве человеческого внутреннего положительного контроля. Окончательная концентрация смеси праймеров составила 500 нм, а концентрация каждой отдельной смеси составила 167 нм. Условия ПЦР-теста были такими же, как описано выше.

ПЦР в реальном времени и составной ПЦР в реальном времени

Использовали от пяти до 10 нг кДНК и X Power SYBR® Green PCR Master Mix (Каталог № 4368577, Thermo Fisher Scientific, США). Температурные условия цикла в Quantstudio 1 ПЦР-системе реального времени (Applied Biosystems, США) были 50 °C на 2 мин, 95 °C на 10 мин, 40 циклов при 95 °C на 15 с и 62 °C for 1 мин и к стадии плавления 95 °C на 10 с и 60 °C на 1 мин. SARS-CoV-2_IBS_E2, SARS-CoV-2_IBS_RdRP2, SARS-CoV-2_IBS_S2 и SARS-CoV-2_IBS_N1 комплекты праймеров использовали для ПЦР-теста в реальном времени для выявления SARS-CoV-2. Кроме того, GAPDH праймеры были использованы для каждого образца в качестве человеческого внутреннего положительного контроля. Финальная концентрация смеси праймеров составила 500 нм.

Результаты

Рекомендации по дизайну и оптимизации праймеров

В предыдущем исследовании мы определили важность процесса проверки и оптимизации комплектов праймеров, которые используются при тестировании на вирус. Таким образом, в настоящем исследовании мы в первую очередь описываем рекомендации по дизайну и оптимизации комплектов праймеров с помощью трех важных шагов(Рис. 1а). Первый шаг состоит в том, чтобы выбрать целевые гены (RdRP, N, E и S), которые необходимо выявить в интересующем нас геноме (SARS-CoV-2), и создать праймер на основании последовательности, которая является целью в каждом гене. В качестве оптимальной целевой последовательности, в том случае, если в транскрипте гена существует вариант сплайсинга, предпочтение отдается целевой области, находящейся в наиболее обильном сплайсинг варианте.Для представленного дизайна праймера использовали различные инструменты, доступные на сайте Primer3 (primer3.wi.mit.edu). Primer3 позволяет отбирать оптимальный праймер на основании Tm, длины праймера, а также стабильности 3′-конца праймера, которые необходимо учитывать при создании каждого комплекта праймеров. Второй шаг — компьютерная валидация последовательностей праймера и ампликона. Идентификация вторичной структуры ампликона и возможности образования само- или гетеродимера самой последовательностью праймеров была спрогнозирована на сайте idtdna.com (sg.idtdna.com). На этом сайте вероятность само- или гетеродимеризации может быть оценена, если высчитать значения ΔG. Наконец, на сайте gemone.ucsc.edu website(genome.ucsc.edu) есть виртуальный ПЦР-инструмент, который можно использовать чтобы спрогнозировать возможность неспецифических реакций в одном и том же геноме, точно также как и в геномах разных видов. Третий шаг состоит в том, чтобы экспериментальным образом подтвердить и оптимизировать комплект праймеров в биологической лаборатории. Мы оптимизировали температуру отжига (Ta) с помощью градиентного ПЦР за счет установления температуры отжига между 50 °C и 65 °C и определения температуры, при которой достигается высочайший уровень амплификации. В качестве меры предосторожности важно заметить, что финальная концентрация комплекта праймеров в смеси ПЦР критична для целевого ПЦР. Следовательно, каждый комплект праймеров концентрации в пределах от 100 нм до 500 нм необходимо проверить на образование димеров. При подтверждении результатов ПЦР электрофорезом эффективность реакции необходимо проверять: соответствуют ли размер полосы ампликона и количество добавленной матрицы.

Чтобы продемонстрировать важность процедуры оптимизации праймеров, мы провели ПЦР (35 циклов), используя различные неоптимальные комплекты праймеров с или без матрицы ДНК (SARS-CoV-кДНК), а также применяя различные условия Ta (Рис. 2). Первый пример продемонстрировал внешний вид ложного образования праймера-димера (Рис. 2а). Димер праймера — побочный продукт ПЦР, который состоит из молекул праймера, которые скрещиваются друг с другом из-за нитей комплементарного основания праймера [22]. В первом примере мы провели ПЦР с ранее заявленным SARS-CoV-2_IBS_RdRP1 комплектом праймеров [9]. Соответствующие данные электрофореза показали появление ложных коротких групп димеров на примерно 30-50 парах оснований (по) вместе с темной группой в ожидаемом размере ампликона 118 по при исходных условиях (Рис. 2а). Фактически, группы праймер-димеров находили при любых условиях, независимо от присутствия матрицы. Кроме того, интенсивность групп праймер-димеров снижалась при повышении температуры. Вид групп праймер-димеров позволяет предположить, что концентрация праймеров и Ta не являются оптимальными, и их необходимо оптимизировать за счет снижения концентрации праймеров и увеличения Ta.

Второй пример продемонстрировал появление ложной длинной цепочки димеров вместе с более короткой праймер-димер группой (Рис. 2b, c). В этих примерах мы провели ПЦР с ранее заявленными SARS-CoV-2_IBS_S1(Рис. 2b) и SARS-CoV-2_IBS_E1 (Рис.2с) комплектами праймеров [9]. Несмотря на то, что появились сильные позитивные группы ожидаемого размера при условиях, включающих матрицу ДНК, длинные цепочки димеров появились при низкой Ta = 50 °C и 55 °C, а не высокой Ta = 60 °C при отсутствии матрицы (красные звездочки на Рис. 2b, c). Эти результаты позволяют предположить, что когда комплект праймеров показывает потенциал к формированию длинной ПЦР, это можно предотвратить с помощью увеличения Ta.

В третьем примере показан низко-эффективный комплект праймеров. Мы провели ПЦР с ранее описанным CDC_RNAse P комплектом прайиеров [9] (Рис.2d). Данные, полученные в результате электрофореза, показали, что при всех условиях можно было наблюдать сильные ложные длинные и короткие цепи праймеров и слабые или не ожидаемые вовсе (Рис.2d). Появление этих сильных скоплений праймеров показало, что у данного комплекта праймеров тенденция к димеризации, которая является более сильной, чем тенденция к скрещиванию с матрицей. Эти результаты доказывают, что данный комплект праймеров должен быть утилизирован, а новый необходимо разработать и оптимизировать.

Последний пример продемонстрировал образование очень длинной неспецифической цепи. В этом примере мы произвели ПЦР с SARS-CoV-2_IBS_N1. Данные электрофореза показали отсутствие цепи праймеров-димеров и сильной ожидаемой цепи при условиях содержания матрицы ДНК (Рис. 2е). Однако появилась ложная очень длинная неспецифичная цепочка возле 400 по при низкой Ta = 50 °C и 55 °C, но не при высокой Ta = 60 °C при отсутствии матрицы ДНК(Рис. 2е). Отсутствие цепи праймеров-димеров показало, что комплект праймеров сам по себе является оптимальным. Однако присутствие неспецифической цепи при низкой Ta предполагает, что оптимальная Ta была выше и близка к Ta = 60 °C.

В заключение, комплекты праймеров, которые демонстрируют образование праймеров-димеров, могут быть оптимизированы за счет повышения Ta, в то время как комплект праймеров, показанный на рисунке (Рис.2d), необходимо переделать. Если их не оптимизировать, ложные праймер-димеры и побочные продукты, которые формируются в процессе, могут привести к образованию ложно-положительной кривой на высоких значениях Ct, близких к 35 циклам и низких температурах плавления, несмотря на присутствие или отсутствие матрицы в ПЦР в реальном времени [23]. При создании комплектов праймеров каждый может следовать рекомендациям, которые мы предложили на Рис.1а.

Дизайн и оптимизация праймеров SARS-CoV-2

В этом исследовании мы планировали разработать протокол обнаружения для традиционного ПЦРтак же, как и для ПЦР в реальном времени. Мы также планировали разработать протокол обнаружения для мультиплексного ПЦР так же, как для мультиплексного ПЦР в реальном времени. Мы создали и оптимизировали праймеры для каждого протокола в соответствии с рекомендациями, изображенными на Рис.1а. Список новых комплектов праймеров, а также наиболее оптимизированных после последних исследований, [9] показан в Таблице 1. Наши комплекты праймеров были созданы специально для выявления SARS-CoV-2, но не других коронавирусов человека, таких как коронавирус человека OC43 (HCoV-OC43), коронавирус человека NL63 (HCoV-NL63), коронавирус человека HKU1 (HCoV-HKU1) или коронавирус человека 229E (HCoV-229E).

Среди комплектов праймеров, которые мы разработали для выявления SARS-CoV-2 при применении ПЦР в реальном времени [9], были комплекты праймеров, которые заново оценили и отобрали на основании руководств по дизайну и оптимизации, представленных на Рис.1а (Таблица 1). Используя отобранные комплекты праймеров, мы провели традиционный ПЦР, как показано на Рис.3, и ПЦР в реальном времени, как показано на Рис.4,5. Более того, заново созданные комплекты праймеров произвели ампликоны размером от 100 по до 400 по. Эти новые комплекты праймеров нацелены на RdRP, E, N, и S гены SARS-CoV-2 (Рис.1b, c) и были использованы для мультиплексного ПЦР Рис.6 (Таблица 1). Для обнаружения человеческого внутреннего контроля мы создали новые комплекты праймеров, нацеленные на ACTB (бета-актин), TBP (TATA-бокс связывающий протеин), 18S рРНК и GAPDH гены Homo sapiens (Таблица 1). Эти внутренние положительные контроли были созданы для контроля качества полученного у волонтера образца кДНК, а также для верификации ПЦР. Новые комплекты праймеров для мультиплексного ПЦР были оптимизированы как показано на Рис.6a, b в соответствии с руководствами, изображенными на Рис.1а.

Создание традиционного протокола ПЦР для выявления SARS-CoV-2

Мы создали протокол на основании метода ПЦР с использованием лучших комплектов праймеров среди комплектов, разработанных в предыдущем исследовании [9] и прошедших оптимизацию согласно руководствам, изображенным на Рис.1а. Мы использовали SARS-CoV-2 кДНК в качестве позитивного контроля, HEK-293T кДНК человеческого происхождения в качестве человеческого внутреннего позитивного контроля, а также CDC_RNAae P (Рис.2d) в качестве праймер-димер контроля. Мы провели ПЦР (35 циклов) для каждого комплекта праймеров с использованием Taq-полимеразы (Рис.3). Результаты электрофореза показали, что SARS-CoV-2 комплекты праймеров SARS-CoV-2_IBS_E2, SARS-CoV-2_IBS_RdRP2, SARS-CoV-2_IBS_S2 и SARS-CoV-2_IBS_N1 производят темные цепочки надлежащего размера (~100 по) только в присутствии SARS-CoV-2 матрицы ДНК, а не HEK-293T кДНК или отсутствии матрицы(Рис.3). SARS-CoV-2 комплекты праймеров человеческого внутреннего контроля продемонстрировали несколько признаков ложных праймер-димер цепочек (Рис.3),а значит, комплект праймеров был эффективно оптимизирован по сравнению с неоптимизированными комплектами праймеров. Мы использовали GAPDH праймеры в качестве человеческого комплекта праймеров для человеческого внутреннего позитивного контроля и обнаружили, что несмотря на то, что SARS-CoV-2 комплекты праймеров не производили никаких определяемых цепочек с HEK-293T кДНК, GAPDH, комплект праймеров производил положительную цепочку в присутствии HEK-293T кДНК(Рис.3). Результаты GAPDH указали на то, что HEK-293T кДНК была надлежащим образом подготовлена. Ввиду того, что SARS-CoV-2 геномная РНК была подготовлена из колонии клеток Vero, изолированной из эпителиальных клеток почки, извлеченных у африканской зеленой обезьяны (резус макака) [19], позитивная GAPDH цепочка, полученная в присутствии SARS-CoV-2 кДНК, указала на то, что кДНК Vero клетки была случайным образом включена в ДНК SARS-CoV-2 (Рис.3).

Улучшение протокола обнаружения SARS-CoV-2 с помощью ПЦР в реальном времени

В своем предыдущем отчете мы представили 9 уникальных комплектов праймеров для определения SARS-CoV-2 [9]. Однако эти комплекты праймеров не были оптимизированы согласно руководствам, представленным на Рис.1а. Таким образом, в текущем исследовании мы оптимизировали и отобрали лучшие комплекты праймеров, чтобы улучшить протокол ПЦР в реальном времени. Используя комплекты праймеров для SARS-CoV-2_IBS_E2, SARS-CoV-2_IBS_RdRP2, SARS-CoV-2_IBS_S2 и SARS-CoV-2_IBS_N1, мы провели анализ ПЦР в реальном времени на каждый комплект праймеров и образец кДНК Волонтера U или SARS-CoV-2 или контроль в отсутствии матрицы (Рис.4). Результаты ПЦР в реальном времени показаны в двух отдельных сценариях для каждого комплекта праймеров: сценарий амплификации и сценарий кривой плавления (Рис.4). Сценарий амплификации показывает колебания значений логарифма (ΔRn) в зависимости от цикла ПЦР, в то время как сценарий кривой плавления показывает динамику разъединения нитей ДНК и последующего освобождения ДНК, связанного с красителем SYBR® Green I [24]. Форма и позиция этой кривой плавления ДНК представляют собой переменные в уравнении GC/AT,что означает длину и последовательность, и могут быть использованы для дифференциации ампликонов при шаге температуры плавления менее 2 °C [24]. Результаты сценариев амплификации и сценария кривой плавления для каждого комплекта праймеров не показали значительного положительного сигнала при значениях Ct ниже 37 для всех четырех SARS-CoV-2 комплектов праймеров (SARS-CoV2_IBS_RdRP2, SARS-CoV2_IBS_S2, SARS-CoV2_IBS_E2 и SARS-CoV2_IBS_N1), в то время как наблюдался положительный сигнал на GAPDH тогда, когда использовали образец кДНК волонтера U (зеленая кривая, Рис.4; Дополнительная таблица 1). Это находится в сильном контрасте с значительными позитивными сигналами, полученными в присутствии SARS-CoV-2 кДНК (голубая кривая, Рис.4). Несоответствие местоположений пиков кривых плавления GAPDH для SARS-CoV-2 и образца волонтера U скорее всего происходит от разницы 11% в последовательности ампликонов у двух видов приматов (Homo sapiens и резус-макака), как установлено в виртуальном ПЦР (Дополнительная таблица 1). Для определения присутствия SARS-CoV-2 мы использовали тот же критерий, что и в предыдущем исследовании [9]: если зафиксирован хотя бы один ген SARS-CoV-2, мы записывали, что «обнаружен SARS-CoV-2», если мы фиксировали только человеческий внутренний позитивный контроль, мы записывали, что «SARS-CoV-2 не обнаружен». Основываясь на этих результатах и применяемых критериях, мы заключили, что волонтер U, наиболее вероятно, не носитель SARS-CoV-2. Взятые вместе эти результаты указывают на то, что использование оптимизированных комплектов праймеров вместе с анализом кривых плавления представляет собой улучшенный протокол определения SARS-CoV-2 без ложно-позитивных результатов.

Создание мультиплексного протокола ПЦР в реальном времени для определения SARS-CoV-2

При наличии оптимизированных комплектов праймеров для ПЦР в реальном времени мы попытались создать альтернативный протокол обнаружения за счет использования мультиплексного ПЦР в реальном времени, при котором все комплекты праймеров смешиваются в одном буферном растворе. За счет создания такого протокола мы хотели снизить необходимые количества образца и реагентов, время подготовки, денежные и трудовые затраты. Для того чтобы получить смесь комплектов праймеров, мы смешали все комплекты праймеров, нацеленные на SARS-CoV-2, в одном буферном растворе, а комплект праймеров человеческого положительного контроля растворили отдельно в буферном растворе. Таким образом, применяя мультиплексный метод, мы смогли снизить количество реакций с 15 до 6. Для того, чтобы снизить образование праймеров-димеров, когда все комплекты праймеров уже смешаны, мы пропорционально снизили концентрацию каждого комплекта праймеров таким образом, что окончательная концентрация всех комплектов праймеров составила 500 нм (125 нм каждый). Остальная часть процедуры была такой же, как и для ПЦР в реальном времени. Результаты, которые мы получили в сценарии амплификации при мультиплексном ПЦР в реальном времени (Рис.5), были практически такими же, как результаты, полученные при ПЦР в реальном времени (Рис.4). В частности, сценарий амплификации показал одну комбинированную кривую реакции для всех четырех комплектов праймеров при значительно низком значении Ct (Рис.5; Дополнительная таблица 1) по сравнению с таким у каждого комплекта праймеров (Рис.4). Точность эксперимента подтвердил сценарий кривой плавления, т.к. кривая плавления показала многочисленные пики в ответ на положительный сигнал, при этом каждый пик представляет собой каждый ампликон соответствующего комплекта праймеров (Рис.4,5; Дополнительная таблица 1). На основании этих результатов мы заключили, что волонтер U наиболее вероятно не носитель SARS-CoV-2. Эти результаты показывают, что заново разработанный протокол мультиплексного ПЦР в реальном времени может быть использован для быстрого и точного выявления SARS-CoV-2 в качестве экономически-эффективной альтернативы протоколу ПЦР в реальном времени.

Создание протокола мультиплексного ПЦР для определенияSARS-CoV-2

В качестве альтернативы традиционному протоколу ПЦР мы продолжили разрабатывать протокол мультиплексного ПЦР для определения SARS-CoV-2, при использовании которого все комплекты праймеров смешивались бы в буферном растворе. Для того, чтобы визуализировать и отделить каждый ампликон каждого комплекта праймеров, мы создали новые комплекты праймеров, целью которых были бы RdRP, S и N гены из генома SARS-CoV-2 и каждый комплект праймеров производил бы ампликоны разного размера (например, 200 по, 300 по, 400 по соответственно). Для комплекта праймеров, целью которого является ген Е, использовали ранее заявленный ARS-CoV-2_IBS_E2 комплект праймеров, производящий ампликон размером 116 по (Таблица 1). Для человеческого внутреннего контроля мы точно таким образом создали новый комплект праймеров, целью которого были бы 18 S рРНК, ACTB (бета-актин) и TBP (ТАТА-связывающий белок) с размером ампликонов 200 по, 300 по и 400 по соответственно. Все комплекты праймеров человеческого внутреннего контроля включали в себя последовательности праймеров, которые человек делит с африканской зеленой обезьяной (резус-макакой), кроме IBS_m_TBP 1 комплекта праймеров. Для того чтобы оптимизировать заново созданные комплекты праймеров, мы провели ПЦР (35 циклов) с SARS-CoV-2 кДНК в качестве позитивного контроля и HEK-293T кДНК человеческого происхождения в качестве человеческого внутреннего позитивного контроля (Рис.6a, b). Результаты электрофореза показали позитивные темные скопления подходящего размера и отсутствие димеров праймеров при наличии SARS-CoV-2 или HEK-293T кДНК, в то время как некоторые комплекты праймеров продемонстрировали созданные димеры праймеров в условиях отсутствия матрицы (Рис.6a, b). Эти результаты указывают на то, что все эти комплекты праймеров были хорошо оптимизированы и показали высокую эффективность амплификации и низкую тенденцию к образованию само- или гетеропраймер-димеров. Основываясь на низком уровне либо полном отсутствии скоплений праймер-димеров, а также на высокой интенсивности скоплений ампликонов, мы отобрали следующие комплекты праймеров для мультиплексного ПЦР протокола выявления SARS-CoV-2: ARS_CoV-2_IBS_m_RdRP 1 (RdRP), SARS_CoV-2_IBS_m_S 1 (S), SARS_CoV-2_IBS_m_N 1 (N), 18S rRNA (18S rRNA), IBS_m_ACTB 1 (ACTB) и IBS_m_TBP 1 (TBP).

Используя комплекты праймеров из стадии оптимизации, мы провели мультиплексный ПЦР для выявления SARS-CoV-2. Для проведения мультиплексного ПЦР мы смешали все комплекты праймеров в буферном растворе, человеческий внутренний позитивный контроль растворили отдельно в буферном растворе, чтобы получить финальную концентрацию комплектов праймеров в 500 нм в обоих случаях. Результаты электрофореза, упомянутые выше, показали четыре позитивных скопления подходящего размера для каждого комплекта праймеров SARS-CoV-2 в единичной нити в присутствии SARS-CoV-2 кДНК (Рис.6с). За исключением позитивного скопления, полученного с SARS-CoV-2_IBS_E2 комплектом праймеров, три другие комплекта праймеров произвели высокоинтенсивные позитивные скопления(Рис.6с). Это совпадает с недавними отчетами о том, что выраженность Е гена в геноме SARS-CoV-2 очень низкая [18]. И наоборот, не было ни одного признака позитивного скопления в HEK-293T кДНК, кДНК волонтера U или в условиях отсутствия матрицы (Рис.6с). В соответствии с результатами, представленными на Рис.6a, b, признаков формирования праймер-димеров обнаружено не было. Результаты электрофореза комплектов праймеров человеческого внутреннего позитивного контроля показали, что было, по крайней мере, одно позитивное скопление в условиях кДНК волонтера U, HEK-293T или SARS-CoV-2, но не при отсутствии матрицы (Рис.6d), подтверждая надежное извлечение РНК из образца волонтера. Основываясь на этих результатах, мы пришли к заключению, что волонтер U наиболее вероятно не носитель SARS-CoV-2. Взятые вместе, эти результаты демонстрируют, что заново созданный мультиплексных протокол ПЦР с оптимизированными комплектами праймеров может быть очень полезным для по быстрого, легкодоступного и визуально подтверждаемого выявления SARS-CoV-2.

Дискуссия

В этом исследовании мы описали детальное и практическое руководство — как разработать и оптимизировать комплекты праймеров за три важных шагах (Рис.1а). Эти руководства могут быть использованы не только для SARS-CoV-2, но и для любого инфекционного вируса, который может появиться в будущем. Основываясь на оптимизированных комплектах праймеров, мы также создали протоколы для выявления SARS-CoV-2, используя методы традиционного ПЦР и ПЦР в реальном времени. Далее мы расширили эти протоколы для мультиплексного ПЦР так же, как и для мультиплексного ПЦР в реальном времени. Эти протоколы, основанные на использовании метода ПЦР, предоставляют многочисленные опции для выбора протокола обнаружения, который подходит для различных экспериментальных сред даже при отсутствии дорогостоящего высокоточного оборудования.

Эти многочисленные альтернативные протоколы выявления SARS-CoV-2, собраны на Рис.7 в блок-схему, чтобы визуально продемонстрировать последовательность шагов и решений. Сначала мы получаем образец от каждого волонтера с помощью мазка из глотки, затем из мазка выделяется вся РНК в реагенте TRIzol, РНК преобразуется в кДНК с помощью обратной транскрипции. Перед тем, как приступить к выявлению генов SARS-CoV-2 методом ПЦР, проводится необязательный тест на качество образца (красная звездочка на Рис.7) с использованием комплектов праймеров человеческого внутреннего позитивного контроля, чтобы подтвердить качество извлеченной РНК, конвертированной в кДНК. В случае если качество образца неадекватно, исследователю необходимо вернуться на стадию взятия образца и взять новый. Этот шаг должен предотвратить временные и трудовые затраты из-за неадекватного образца РНК или кДНК. Следующим шагом исследователь может определить протокол выявления, с которым собирается работать, ответив на вопрос «Хотите ли вы увидеть реакцию амплификации в реальном времени?». Если ответ «да», исследователь выбирает протоколы, в основе которых – метод ПЦР в реальном времени. Если ответ «нет», исследователь выбирает протоколы, в основе которых – традиционный метод ПЦР. Следующий вопрос «Хотите ли вы увидеть каждый ампликон отдельно?» касается использования опции мультиплексного ПЦР. Если ответ «нет», исследователь решает действовать дальше с использованием мультиплексного протокола. После ПЦР исследователь определяет, положительный или отрицательный к вирусу SARS-CoV-2 каждый из образцов волонтеров, основываясь на размерах и интенсивности каждого скопления ампликонов, согласно традиционным ПЦР протоколам или значении Ct (значение Ct < 37 циклов), и сценарии кривой плавления, согласно протоколу ПЦР в реальном времени (Рис.7).

Когда исследователь принимает решение применить протокол традиционного ПЦР или ПЦР в реальном времени, важно учитывать достоинства и недостатки каждого из них. Протоколы ПЦР в реальном времени позволяют не только визуализировать реакцию амплификации в реальном времени, но и подтвердить ее с помощью сценария кривой плавления, в то же время невозможно визуализировать появление ложных димеров праймеров. Протоколы традиционного ПЦР удобны и экономически выгодны, есть возможность визуализировать образование ложных димеров праймеров. В то же время этот метод невозможно автоматизировать ввиду требования проведения электрофореза геля.

Преимущества мультиплексного ПЦР (традиционного или в реальном времени): быстрое тестирование, точность определения наличия вируса, экономическая выгода. Недостатки такого подхода: риск, что смесь нескольких комплектов праймеров может повлиять на процесс амплификации ввиду конкуренции между комплектами праймеров за ограниченные ресурсы, например, полимеразы и дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTPs). Результаты ПЦР в реальном времени могут продемонстрировать точность каждого ампликона на основе анализа кривой плавления, в то время как результаты ПЦР в реальном времени не могут этого сделать ввиду пересечения значений Tm нескольких ампликонов. Согласно нашим результатам, мультиплексный ПЦР в реальном времени, производящий RdRP, S, E и N ампликоны, производит также спрогнозированные значения Tm (Дополнительная таблица 1;Рис.4) и только два, а не четыре пика на кривой плавления (Дополнительная таблица 1;Рис.5). Несмотря на то, что значения на пиках были в рамках спрогнозированных значений Tm (Дополнительная таблица 1), было невозможно отделить значение пика каждого ампликона на кривой плавления (Рис.5). Чтобы преодолеть это ограничение, мы представили протокол мультиплексного ПЦР, который позволяет произвести четкое различие между ампликонами в одном единственном геле (Рис.6с). Эти соображения должны помочь исследователю сделать разумный выбор относительно наиболее подходящего протокола для выявления SARS-CoV-2.

В нашем предыдущем исследовании мы определили критические моменты, связанные с неоптимизированными комплектами праймеров, наличие которых ведет к ложноположительным результатам [9]. Продаются и поставляются правительством наборы с нераскрытой последовательностью комплектов праймеров. Некоторые из этих диагностических наборов, праймеры которых не раскрываются, могут содержать неоптимизированные комплекты праймеров, которые производят ложноположительный результат. В текущем исследовании мы обнаружили многочисленные примеры того, что неоптимизированные комплекты праймеров производят длинные и короткие цепочки димеров (Рис. 2), которые могут быть потенциальным источником ложноположительных результатов при использовании протоколов традиционного ПЦР и ПЦР в реальном времени. В соответствии с этой возможностью сообщалось, что димеры праймеров могут неожиданно быть обнаружены в геле для электрофореза или при анализе кривой плавления с помощью зеленого красителя SYBR [25]. Таким образом, мы настоятельно рекомендуем, чтобы критические комплекты праймеров для диагностических наборов для выявления SARS-CoV-2 методом ПЦР были раскрыты и оптимизированы согласно нашему руководству.

Наше исследование — первое руководство для протоколов обнаружения SARS-CoV-2. В дополнение мы полностью раскрыли и оптимизировали комплекты праймеров, нацеленные на четыре основных гена SARS-CoV-2. Имея эту информацию и данные из нашего предыдущего исследования [9], любой исследователь с базовыми знаниями биологии способен разработать лекгодоступный, бюджетный, быстрый, гибкий и высокоточный набор для выявления SARS-CoV-2. Мы надеемся, что наша работа поможет создать широкомасштабный высокоточный подход, выявляющий людей без симптомов для предотвращения дальнейшей передачи, раннего вмешательства и лечения COVID-19.

Примечания

1. Cascella, M., Rajnik, M., Cuomo, A., Dulebohn, S. C. & Di Napoli, R. Features, Evaluation and Treatment Coronavirus (COVID-19) (StatPearls Publishing, Treasure Island, FL, 2020).
2. Chan, J. F. et al. A familial cluster of pneumonia associated with the 2019 novel coronavirus indicating person-to-person transmission: a study of a family cluster. Lancet 395, 514–523 (2020).
3. Xu, Z. et al. Pathological findings of COVID-19 associated with acute respiratory distress syndrome. Lancet Respir. Med. 8, 420–422 (2020).
4. Worldometer. COVID-19 CORONAVIRUS PANDEMIC. worldometers.info (2020).
5. (CDC), U.S.C.f.D.C.a.P. How COVID-19 Spreads. cdc.gov (2020).
6. News, N. How does coronavirus spread? nbcnews.com (2020).
7. Wolfel, R. et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature 581, 465–469 (2020).
8. Kupferschmidt, K. Study claiming new coronavirus can be transmitted by people without symptoms was flawed. Science doi.org (2020).
9. Won, J. et al. Development of a laboratory-safe and low-cost detection protocol for SARS-CoV-2 of the coronavirus disease 2019 (COVID-19). Exp. Neurobiol. 29, 107–119 (2020).
10. Liu, Y., Gayle, A. A., Wilder-Smith, A. & Rocklov, J. The reproductive number of COVID-19 is higher compared to SARS coronavirus. J. Travel Med. doi.org (2020).
11. Sanche, S. et al. High contagiousness and rapid spread of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2. Emerg. Infect. Dis. doi.org (2020)
12. Wallinga, J. & Teunis, P. Different epidemic curves for severe acute respiratory syndrome reveal similar impacts of control measures. Am. J. Epidemiol. 160, 509–516 (2004).
13. Chen, L. Y. Heartbreak in the Streets of Wuhan (Bloomberg Businessweek, 2020).
14. Andrew Ryan, J. H.a. T. A. State Figures on Testing Raise Questions About Efforts to Contain Outbreak (The Boston Globe, 2020).
15. Morning, P. 80% of Rapid COVID-19 Tests the Czech Republic Bought From China are Wrong Prague Morning (Prague Morning, 2020).
16. Chantal, B. F. et al. Analytical sensitivity and efficiency comparisons of SARS-COV-2 qRT-PCR assays. doi.org (2020).DuBridge, R. B. et al.
17. Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system. Mol. Cell Biol. 7, 379–387 (1987).
18. Kim, D. et al. The architecture of SARS-CoV-2 transcriptome. Cell 181, 914–921 (2020).
19. Govorkova, E. A., Murti, G., Meignier, B., de Taisne, C. & Webster, R. G. African green monkey kidney (Vero) cells provide an alternative host cell system for influenza A and B viruses. J. Virol. 70, 5519–5524 (1996).
20. Park, W. B. et al. Virus isolation from the first patient with SARS-CoV-2 in Korea. J. Korean Med. Sci. 35, e84 (2020).
21. Untergasser, A. et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res 40, e115 (2012).
22. Gräntzdörffer, A. & Nemetz, C. in Cell-Free Protein Expression (ed. Swartz, J. R.) Ch. 5 (Springer, Berlin, Heidelberg, 2003).
23. Pfaffl, M. in Rapid Cycle Real-Time PCR (eds Meuer, S. et al.) 281–291 (Springer, Berlin, Heidelberg, 2001).
24. Ririe, K. M., Rasmussen, R. P. & Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Anal. Biochem. 245, 154–160 (1997).
25. Ruiz-Villalba, A., van Pelt-Verkuil, E., Gunst, Q. D., Ruijter, J. M. & van den Hoff, M. J. Amplification of nonspecific products in quantitative polymerase chain reactions (qPCR). Biomol. Detect Quantif. 14, 7–18 (2017).
26. Tsubouchi, K. et al. The CD44 standard isoform contributes to radioresistance of pancreatic cancer cells. J. Radiat. Res. 58, 816–826 (2017).
27. Song, W. et al. Validation of housekeeping genes for the normalization of RT-qPCR expression studies in oral squamous cell carcinoma cell line treated by 5 kinds of chemotherapy drugs. Cell Mol. Biol. (Noisy-le.-Gd.) 62, 29–34 (2016).