Человеческие моноклональные антитела блокируют связывание шиповидного белка SARS-CoV-2 с ангиотензинпревращающим ферментом 2

Человеческие моноклональные антитела блокируют связывание шиповиднго белка SARS-CoV-2 c ангиотензипреващающим ферментом 2

Авторы: Xiangyu Chen et al.

Перевод: Евгения Фрей

В настоящее время нет ни одобренных профилактических вакцин, ни препаратов для специфической терапии COVID‑19. Блокирующие моноклональные антитела (МкАТ), благодаря их уникальной специфичности к антигену, являются перспективным средством для борьбы с вирусной инфекцией (10, 11). Выделение и клонирование блокирующих МкАТ, способных специфически связываться с поверхностными вирусными белками и блокировать проникновение вируса в клетку, — многообещающий метод профилактики и лечения COVID‑19, в особенности в условиях текущей пандемии, когда эффективные вакцины или специфические препараты отсутствуют. Цель данной работы — идентификация и клонирование блокирующих МкАТ, способных предотвратить слияние вируса SARS‑CoV‑2с клетками-хозяевами, из репертуара В-клеток иммунной памяти пациентов, недавно перенёсших COVID‑19.

Вирусы SARS‑CoV и SARS‑CoV‑2 используют высоко гликозилированный гомотримерный шиповидный белок S для связывания со специфическим рецептором, что позволяет вирусу проникнуть внутрь клетки-хозяина (3, 12–15). Белок S вируса SARS‑CoV‑2 состоит из двух субъединиц, S1 и S2. Специфическим рецептором для вирусов SARS‑CoV и SARS‑CoV‑2 является ангиотензипревращающий фермент 2 (АПФ2). Чтобы связаться с рецептором, белок S претерпевает значительные конформационные изменения. Как следствие, экспонируется рецептор-связывающий домен (РСД) и ключевые аминокислотные остатки, непосредственно обеспечивающие связывание с рецептором. Белок S находится в метастабильном состоянии, и связывание РСД с АПФ2, вероятно, приводит к отделению субъединиц S1 и S2 друг от друга. В результате происходит опосредованное субъединицей S2 слияние вируса с мембраной клетки-хозяина, и вирус проникает в клетку (16–18). Именно РСД делает возможным слияние вируса SARS‑CoV‑2 с клеткой и, следовательно, РСД является наиболее подходящей мишенью для нейтрализующих антител. В литературе нет данных о МкАТ, специфически блокирующих взаимодействие РСД вируса SARS‑CoV‑2 и АПФ2. Недавно было показано, что специфичные по отношению к субъединице S1 моноклональные антитела, полученные от иммунизированных трансгенных мышей, экспрессирующих вариабельные части тяжёлых и лёгких цепей человеческих Ig, нейтрализуют инфекцию SARS‑CoV и SARS‑CoV‑2. Однако механизм этого явления не связан с блокадой взаимодействия РСД‑АПФ2 и точно не охарактеризован (19).

Для клонирования МкАТ использовались образцы крови трёх пациентов, недавно перенёсших COVID‑19; сыворотка, полученная из этих образцов, блокировала связывание с АПФ2. С помощью проточной цитометрии SARS‑CoV‑2 РСД‑специфичные, изотип‑переключённые IgG+ В‑клетки памяти были рассортированы в 96-луночные планшеты (сортировка единичных клеток, так что в одну лунку планшета попадает одна клетка). Для амплификации VH- и VL-кодирующих нуклеотидных последовательностей из каждой отдельной В-клетки памяти использовалась ПЦР с обратной транскрипцией. [VH — вариабельный участок тяжёлой цепи, VL — вариабельный участок лёгкой цепи]. Затем обе последовательности были вставлены в экспрессионные плазмиды, кодирующие константные участки тяжёлой и лёгкой цепей IgG1 человека (рис. 1d) (21). SARS‑CoV‑2 РСД‑специфичные IgG+ В‑клетки памяти в большом количестве обнаруживались у пациентов, перенёсших COVID‑19, но не у здоровых добровольцев из контрольной группы (рис. 1е). Это подтверждает специфичность используемого метода сортировки. В результате были получены три пары экспрессионных плазмид со встроенными VH- и VL-последовательностями IgG.

После завершения культивирования были выделены МкАТ, названные 311mab‑31B5, 311mab‑32D4 и 311mab‑31B9, соответственно. Результаты твердофазного ИФА показали, что все три МкАТ способны к прочному специфическому связыванию с РСД вируса SARS‑CoV‑2 (рис. 1f). Чтобы выяснить, могут ли полученные МкАТ блокировать взаимодействие между РСД вируса SARS‑CoV‑2 и АПФ2, были проведены соответствующие тесты. Оказалось, что 311mab‑31B5 и 311mab‑32D4 эффективно блокируют взаимодействие РСД вируса SARS‑CoV‑2 и АПФ2 (IC50 = 0,0332 и 0,0450 мкг/мл, соответственно), тогда как антитела 311mab‑31B9 не обладают таким свойством (рис. 1g). Способность антител 31B5- и 32D4 блокировать взаимодействие между РСД вируса SARS‑CoV‑2 и АПФ2 была также подтверждена методом проточной цитометрии (рис. 1h, i). Способность антител к нейтрализации вирусного антигена оценивалась при помощи лентивирусных частиц, псевдотипированных гликопротеином S вируса SARS‑CoV‑2 (22). Антитела 311mab‑31B5 и 311mab‑32D4 эффективно предотвращали слияние псевдовируса с клетками, эктопически экспрессирующими АПФ2, что согласуется с результатами твердофазного ИФА и проточной цитометрии.

Таким образом, были успешно клонированы два вида человеческих блокирующих МкАТ; для этого использовались SARS‑CoV‑2 РСД-специфичные В‑клетки памяти, выделенные от пациентов, перенёсших COVID-19. Полученные МкАТ обладают способностью специфически связываться с РСД вируса SARS‑CoV‑2, блокировать взаимодействие между РСД вируса SARS‑CoV‑2 и его рецептором, АПФ2; а также способностью нейтрализовать инфекцию, вызванную вирусом, псевдотипированным гликопротеином SARS‑CoV‑2. Моноклональные антитела, блокирующие взаимодействие между РСД вируса SARS‑CoV‑2 и АПФ2, выделены впервые. Описанные в данной статье МкАТ представляют огромный интерес, поскольку могут быть использованы для специфической профилактики и лечения COVID‑19.

закрыть меню

УвеличитьОригинал

Рисунок 1.

Список литературы

1. World Health Organization. who.int situation-reports/20200318-sitrep-58-covid-19.pdf?sfvrsn=20876712_2. (2020).
2. Wu, F. et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 579, 265–269 (2020).
3. Zhou, P. et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature 579, 270–273 (2020).
4. Zhu, N. et al. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. N. Engl. J. Med. 382, 727–733 (2020).
5. Huang, C. et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 395, 497–506 (2020).
6. Wang, D., et al., Clinical characteristics of 138 hospitalized patients with 2019 novel coronavirus-infected pneumonia in Wuhan, China. JAMA, 2020. https://doi.org/10.1001/jama.2020.1585. [Epub ahead of print].
7. Yang, X., et al., Clinical course and outcomes of critically ill patients with SARSCoV-2 pneumonia in Wuhan, China: a single-centered, retrospective, observational study. Lancet Respir Med., pii: S2213-2600(20)30079-5. (2020).
8. Chen, N. et al. Epidemiological and clinical characteristics of 99 cases of 2019 novel coronavirus pneumonia in Wuhan, China: a descriptive study. Lancet 395, 507–513 (2020).
9. World Health Organization. https://www.who.int/dg/speeches/detail/whodirector-general-s-opening-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19---11-march-2020. (2020).
10. Marston, H. D., Paules, C. I. & Fauci, A. S. Monoclonal antibodies for emerging infectious diseases—borrowing from history. N. Engl. J. Med. 378, 1469–1472 (2018).
11. Saylor, C., Dadachova, E. & Casadevall, A. Monoclonal antibody-based therapies for microbial diseases. Vaccine 27, G38–46 (2009).
12. Jun Lan, J. G., et al, Crystal structure of the 2019-nCoV spike receptor-binding domain bound with the ACE2 receptor. bioRxiv, 2020. 2020.02.19.956235; doi.org.
13. Li, F. Structure, function, and evolution of coronavirus spike proteins. Annu Rev. Virol. 3, 237–261 (2016).
14. Li, F. et al. Structure of SARS coronavirus spike receptor-binding domain complexed with receptor. Science 309, 1864–8 (2005).
15. Yan, R., et al., Structural basis for the recognition of the SARS-CoV-2 by full-length human ACE2. Science 367, 1444–8 (2020).
16. Gui, M. et al. Cryo-electron microscopy structures of the SARS-CoV spike glycoprotein reveal a prerequisite conformational state for receptor binding. Cell Res. 27, 119–129 (2017).
17. Kirchdoerfer, R. N. et al. Pre-fusion structure of a human coronavirus spike protein. Nature 531, 118–21 (2016).
18. Wrapp, D. et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science 367, 1260–1263 (2020).
19. Chunyan Wang, W. L., et al, A human monoclonal antibody blocking SARS-CoV-2 infection. bioRxiv, 2020. 2020.03.11.987958; doi.org.
20. Pallesen, J. et al. Immunogenicity and structures of a rationally designed prefusion MERS-CoV spike antigen. Proc. Natl Acad. Sci. USA 114, E7348–E7357 (2017).
21. Smith, K. et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4, 372–84 (2009).
22. Xiuyuan Ou, Y. L. et al. Characterization of spike glycoprotein of 2019- nCoV on virus entry and its immune cross- reactivity with spike glycoprotein of SARS-CoV. Nat. Commun. https://doi.org/10.21203/rs.2.24016/v1 (2020).