Эффективность некоторых противовирусных агентов в отношении COVID-19: исследования in vitro
Эффективность некоторых противовирусных агентов в отношнии COVID-19: исследования in vitro
Авторы: Xi Wang, Ruiyuan Cao, Huanyu Zhang, Jia Liu, Mingyue Xu, Hengrui Hu, Yufeng Li, Lei Zhao, Wei Li, Xiulian Sun, Xinglou Yang, Zhengli Shi, Fei Deng, Zhihong Hu, Wu Zhong, Manli Wang
Перевод: Фонд профилактики рака
С декабря 2019 года новое заболевание COVID-19, вызываемое тяжелым острым респираторным синдромом коронавируса 2 (SARS-CoV-2), быстро распространилось более чем в 200 странах, заразило более 1,5 миллиона человек, вызвало 92 798 смертей (данные по состоянию на 10 апреля 2020 года). Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) 11 марта объявила о пандемии COVID-19 и призвала ускорить разработку диагностических процедур, вакцин и лекарств для борьбы с этим новым заболеванием. Кроме новой коронавирусной инфекции, вирусные инфекции гриппа на протяжении многих лет представляли собой постоянную угрозу для глобального общественн ого здравоохранения. Только в Соединенных Штатах, по оценкам Центра по контролю и профилактике заболеваний (CDC), в течение зимнего сезона 2019-2020 годов было зарегистрировано по меньшей мере 39 миллионов заболеваний, 400 000 госпитализаций и 24 000 смертей от гриппа (https://www.cdc.gov/flu/weekly/index.htm). Учитывая, что текущая циркуляция SARS-CoV-2 сопровождается другими вирусными инфекциями гриппа, изучение доступных и эффективных препаратов для лечения обоих заболеванийпредставляет большой интерес.
Действительно, на ранних стадиях вспышки COVID-19 некоторые препараты для лечения гриппа (например, осельтамивир) применялись для лечения больных COVID-19 [1, 2]. Ранее мы сообщали, что фавипиравир (Т705), препарат против гриппа, одобренный в Японии и Китае, показал определенную эффективность против SARS-CoV-2 в исследованиях in vitro [3]. Кроме того, умифеновир, препарат против гриппа с основным противовирусным компонентом гемагглютинином (HA), используется в клиническом испытании против COVID-19 (ChiCTR2000029573) и недавно был добавлен в Руководство по диагностике и лечению COVID-19 (шестое и седьмое издания) в Китае. Недавнее ретроспективное исследование показало, что лечение умифеновиром увеличивает количество выздоровевших и снижает показатели смертности пациентов от COVID-19 [4]. Однако, насколько нам известно, системный анализ эффективности препаратов от гриппапротив SARS-CoV-2 не проводился.
В данном исследовании мы провели оценку эффективности шести доступных в настоящее время и лицензированных препаратов от гриппа при лечении SARS-CoV-2. Эти препараты включают умифеновир, балоксавир, ланинамивир, осельтамивир, перамивир и занамивир [5, 6]. Ингибиторы M2 (амантадин и римантадин) не включены в данное исследование, так как они не были рекомендованы ВОЗ для лечения гриппа из-за лекарственной устойчивости. На первом этапе цитотоксичность соединений в линии клеток почки африканской зеленой мартышки Vero E6 (ATCC-1586) измерялась с помощью стандартного метода подсчета клеток kit-8 (CCK8). Затем клетки инфицировали SARS-CoV-2 с кратностью инфицирования (MOI) 0,05 в присутствии тестируемого соединения или диметилсульфоксида (ДМСО) контроля. Линии доза-реакции строились путем количественного определения числа копий вирусной РНК в супернатанте инфицированной клетки через 48 ч. после заражения (p. i.). Как показано на рисунке 1А, умифеновир эффективно ингибировал вирусную инфекцию в исследованиях in vitro; 50%-ная максимальная эффективная концентрация (EC 50 ) и 50%-ная цитотоксическая концентрация (CC 50 ) умифеновира составили 4,11 (3,55-4,73) и 31,79 (29,89-33,81) мкм соответственно, а индекс селективности (SI = CC50/EC50) — 7,73. Балоксавир частично ингибировал инфекцию SARS-CoV-2 (~29%) при высокой концентрации 50 μM (рис. 1А). Напротив, ланинамивир, осельтамивир, перамивир и занамивир не ингибировали SARS- CoV-2 даже при самых высоких концентрациях препарата (рис. 1А). Противовирусное действие соединений оценивалось также путем наблюдения цитопатических эффектов (ЦПЭ) и иммунофлуоресцентного окрашивания инфицированных клеток. Как показано на дополнительном рисунке S1, через 48 ч. после инфицирования только в клетках, обработанных умифеновир, но не другими пятью препаратами, экспрессия вирусного генома и наблюдаемый цитопатический эффект (CPE) к SARS-CoV-2 были существенно снижены. Следует отметить, что мы также проводили исследование некоторых линий клеток легких человека, например, фибробласты легких эмбриона человека MRC-5 и линию клеток рака легких Calu-3, однако они были не очень эффективны для репликацииSARS-CoV-2 и поэтому не использовались для этого исследования.
Помимо вируса гриппа, сообщалось, что умифеновир ингибирует широкий спектр вирусов, вмешиваясь в несколько этапов цикла репликации вируса [7]. Воздействие умифеновира на стадию репликации SARS-CoV-2 было исследовано путем проведения предварительного эксперимента с замером временных контрольных точек с кратностью инфицирования (MOI) 0,05. Умифеновир инкубировали с клетками в стадии начала проникновения вируса (Entry), в стадии после начала проникновения (Post-entry) и в течение всего процесса заражения (Full-time), а результат действия вируса количественно определяли методом qRT-ПЦР. Полученные данные показали, что умифеновир эффективно блокирует вирус как на стадии проникновения, так и сразу после проникновения. Он оказывает сильное влияние на скорость проникновение вируса (~75% ингибирования) с меньшим влиянием на события после проникновения (~55% ингибирования) (рис. 1Б). Кроме того, вестерн-блоттинг (рис. 1С) и иммунофлуоресцентная микроскопия (дополнительный рисунок S2) подтвердили, что экспрессия вирусного генома была резко снижена в течение всего периода действия (Full-time) (13% от группы ДМСО, рис. 1С), и показали более значительный ингибирующий эффект на стадии начала проникновения (41%), чем на стадии после началапроникновения (61%).
Далее были проведено детальное исследование того, как умифеновир блокирует поступление SARS-CoV-2 в клетки. Вирусу (кратностью инфицирования MOI = 0,05) позволяли связываться с клетками Vero E6 при 4 °C в течение 1 часа в присутствии умифеновира (10 мкм) или контроля ДМСО. Вирусные частицы, связанные с клеткой (связанные вирионы) и находящиеся в супернатанте (несвязанные вирионы), анализировали методом qRT-ПЦР. Полученные результаты показали, что лечение умифеновиром приводит к достоверному снижению эффективности связывания (67%) по сравнению с контрольной группой (Р < 0,05) (Рис. 1d). Соответственно, доля несвязанных вирионов значительно увеличилась до 156% от контрольной группы после леченияумифеновиром (Р < 0,001) (Рис. 1d).
Далее был проанализировано внутриклеточные движение вируса. Как мы недавно сообщали, внутри инфицированных клеток SARS-CoV-2 подвергался транспортировке везикул, которая сначала осуществлялась ранними эндосомами (EEs), а затем далее транспортировалась в эндолисосомы (ELs) [8]. Ко-локализация вирионов с эндосомами (EEs) или эндолисосомами (ELs) визуализировалась методом иммунофлуоресцентной микроскопии и анализировалась статистически (n > 150 клеток). Как показано на рисунке 1е и дополнительном рисунке S3, в каждом отслеживаемом временном отрезке не было достоверной разницы в количестве вирионов, ко-локализованных с EEs, при сравнении групп, получавших ДМСО и умифеновир, хотя по мере прохождения инфекции (30, 60 и 90 мин p.i.) уровни ко-локализации значительно снижались как в группах, получавших ДМСО (24,0%, 5,1% и 3,2%), так и в группах, получавших умифеновир (21,4%, 4,1% и 2,8%), что свидетельствует о том, что некоторые вирионы уже транспортировались из EEs на следующую стадию транспортировки везикул. В отличие от этого, при 60 мин p.i. в группе, получавшей умифеновир, несколько более высокий процент вирионов транспортировался в ELs (22,4%), чем в группе ДМСО (18,3%) (Р < 0,05) (Рис. 1e, f). Через 90 мин после начала лечения в группе ДМСО было обнаружено значительно меньше вирионов (~13,5%), в то время как в группе, получавшей умифеновир, оставалось значительно больше вирионов (~23,6%), что свидетельствует о том, что препарат захватил вирус в группе ДМСО (Р < 0,001) (Рис. 1e, f). Взятые вместе, эти результаты показали, что умифеновир препятствует не только вирусному прикреплению, но и высвобождениюSARS-CoV-2 из внутриклеточных везикул (ELs).
Среди испытанных препаратов ланинамивир, осельтамивир, перамивир и занамивир являются ингибиторами нейраминидазы (NA), которые наиболее широко назначаются для профилактики и лечения гриппа. Несмотря на то, что SARS-CoV-2 не имеет в своем составе аналогов NA, ингибиторы NA, такие как осельтамивир, тем не менее используются клинически при лечении пациентов COVID-19 [1, 2]. Наши данные показывают, что эти ингибиторы NA не были активны против SARS-CoV-2 (Рис. 1А), что согласуется с выводом о том, что осельтамивир и занамивир были неэффективны в ингибировании SARS-CoV-2. Балоксавир марбоксил — это новый препарат против гриппа, который избирательно ингибирует эндонуклеазную активность вирусной полимеразы, ответственной за захват покрытых каплями праймеров из мРНК хозяина для инициации транскрипции вирусной мРНК. Однако этот механизм "захвата капилляров" эндонуклеазы не разделяется коронавирусами, которые кодируют свои собственные ферменты для образования 5ʹ-мРНК структур [10]. Это может объяснить факт того, почему балоксавир не смог блокировать инфекцию SARS-CoV-2 (Рис. 1а). Во время проведения этого исследования Чой и др. также показали, что осельтамивир и балоксавирне смогли ингибировать SARS-CoV-2 в исследованиях in vitro [11].
Умифеновир, производное от индола, уже несколько десятилетий лицензирован в России и Китае как противовирусное средство от гриппа. Это препарат широкого спектра действия против широкого спектра оболочечных и безоболочечных вирусов. Умифеновир взаимодействует преимущественно с ароматическими аминокислотами, и влияет на несколько стадий жизненного цикла вируса, либо непосредственно поражая вирусные белки, либо связанные с вирусом факторы хозяина [7]. Например, в вирусе гриппа кристаллические структуры показали, что умифеновир вводится в гидрофобный карман слияния субъединицы HA, тем самым препятствуя низкотемпературному конформационному изменению HA и блокируя процесс слияния [12]. При вирусе гепатита С умифеновир нарушал как прикрепление вируса, так и внутриклеточное движение везикул [13]. Кроме того, мы обнаружили, что умифеновир играет определенную роль в интерференции связывания SARS-CoV-2 (Рис. 1d) и внутриклеточного оборота везикул (Рис. 1e, f). Умифеновир также может связываться с липидными мембранами и изменять конфигурацию мембран цитоплазмы или эндосомы, которые имеют решающее значение для прикрепления и слияния вирусов [7]. Можно было бы дополнительно исследовать,поражает ли умифеновир вирус и/или клетки, используя опубликованный метод [14].
Таким образом, из шести препаратов против гриппа только умифеновир эффективно подавлял SARS-CoV-2. Функционально он блокирует распространение вируса, препятствуя его прикреплению и распространению через ELs. Хотя SI умифеновира относительно низок (SI = 7,73), как у любого перепрофилированного препарата, его фармакокинетический профиль, включая максимальную концентрацию (Cmax), более важен для прогноза эффективности. Считается, что если максимальная концентрация Cmax достигает EC 90 , препарат, скорее всего, будет эффе ктивен; в то время как если Cmax достигает EC 50 , препарат, возможно, эффективен в исследованиях in vivo. У человека однократное оральное введение 800 мг умифеновира приводит к Cmax ~4,1 мкм [15], и эта дозировка эффективна и безопасна против различных вирусов гриппа со значениями EC 50 в диапазоне от 2,5 до 20 мкм [7, 16]. Умифеновир также проявлял противовоспалительнуюактивность, что может повысить его эффективность в исследованиях in vivo [16].
Учитывая, что EC 50 (4,11 мкм) умифеновира против SARS-CoV-2 сравнима или даже ниже, чем у вирусов гриппа, мы, таким образом, предполагаем, что умифеновир потенциально эффективен для лечения пациентов с COVID-19. Однако текущая доза умифеновира (200 мг, 3 раза / сут), рекомендованная китайскими руководствами, может быть недостаточной для достижения идеальной терапевтической эффективности для ингибирования инфекции SARS-CoV-2 и должна быть повышена. Это предположение должно быть подтверждено дальнейшими клиническими испытаниями.